Diplômé en littérature de la prestigieuse université de Princeton. Il est également passionné de musique et pendant ses années universitaires, il voyage à travers le monde pour chanter a capella avec un groupe « The Princeton Tigertones ». Il part ensuite à Los Angeles, en 1995, pour devenir acteur. Il fait différents petits boulots derrière la caméra pour découvrir le milieu du cinéma avant de se présenter à des castings. Wentworth Miller explique: "Je suis donc parti travailler à Los Angeles pour une compagnie qui développait des téléfilms. En fait, mon job consistait principalement à faire des photocopies et aller chercher des sandwichs pour mon patron"[6]. Il travaillait également dans "des agences, des sociétés de management, des chaînes de télé, des compagnies de production".

En 1998, il fait ses débuts devant la caméra dans un épisode de la deuxième saison de Buffy contre les vampires. Après de nouvelles apparitions dans Popular , Le Monde de Joan et Urgences (2000), Wentworth connaît son premier grand rôle dans la mini-série fantastique Dinotopia (2002). Il tourne également dans le film "La couleur du mensonge" où il joue le rôle d'un métis aux côtés d'Anthony Hopkins et Nicole Kidman, puis dans Underworld avec Kate Beckinsale. Il interprète actuellement le rôle de Michael Scofield dans la série Prison Break. On a également pu l'apercevoir dans les clips vidéos de Mariah Carey It's Like That et We Belong Together. Ceux-ci ont été réalisés par Brett Ratner qui a réalisé le pilote de Prison Break. Par ailleurs, Wentworth vient d'achever son premier script qu'il décrit comme "Une histoire d'amour avec un soupçon d'Hitchcock. Un croisement entre Le Beau-père, L'Ombre d'un doute et la mythologie de Dracula" .